Význam metabolitů vitaminu D a správnost jejich stanovení – editorial


Autoři: Radovan Bílek
Působiště autorů: Endokrinologický ústav, Praha
Vyšlo v časopise: Vnitř Lék 2017; 63(6): 384-385
Kategorie: Editorialy

Komentář k | Editorial on

Vaňuga A et al. Úskalia stanovenia vitamínu D. Vnitř Lék 2017; 63(6): 403–408.

Vitamin D je neaktivním prekurzorem biologicky účinného 1α,25-dihydroxyvitaminu D [1α,25(OH)2D], který spolu s parathormonem a kalcitoninem řídí homeostázu vápníku. Do organizmu se vitamin D dostává exogenně ve formě vitaminu D2 (ergokalciferol) přítomného např. v rybím oleji a mléce, ale hlavním zdrojem vitaminu D je jeho endogenní biosyntéza z prekurzoru 7-dehydrocholestrolu, u kterého je fotolyticky po expozici plazmatické membrány keranocytů v kůži slunečním světlem o vlnových délkách 285–320 nm otevřen kruh B. Z tohoto previtaminu D3 vzniká spontánní izomerací při tělesné teplotě vitamin D3 (cholekalciferol).

Z hlediska biologické funkce je otázkou, zda je vitamin D2 rovnocenný s vitaminem D3. Někteří autoři uvádějí, že vitamin D2 zvyšuje hladinu 25(OH)D méně účinně než vitamin D3 a že nutriční efekt obou vitaminů D není ekvivalentní, popř. že podávání D3 starším pacientům vedlo k redukci počtu zlomenin, přičemž tohoto výsledku nebylo dosaženo podáváním D2 apod. Obvykle je koncentrace cirkulujícího vitaminu D2 a jeho metabolitů více než 10krát nižší než koncentrace vitaminu D3 a jeho metabolitů. Oba druhy vitaminu D, tj. D2 a D3, se liší v postranním řetězci molekuly na 17β-pozici sekosteroidu (vitamin D2 má jednu dvojnou vazbu a jednu metylovou skupinu navíc), jejich další metabolická cesta je ale stejná, tj. pomocí hydroxyláz patřících do rodiny cyto­chrom P450 enzymů nejprve probíhá hydroxylace vitaminu D v poloze C25 prostřednictvím v játrech produkované 25-hydroxylázy za vzniku 25-hydroxyvitaminu D [25(OH)D]. Koncentrace tohoto biologicky ještě ne­účinného metabolitu vitaminu D v krvi odráží míru zásobení organizmu vitaminem D z exogenních (D2) i endogenních (D3) zdrojů.

Biologicky aktivní, hormonálně účinný 1α,25-dihydroxyvitamin D [1α,25(OH)2D] vzniká v ledvinách účinkem hormonálně [PTH stimuluje, 1α,25(OH)2D vykazuje negativní zpětnou vazbu] regulované 1α-hydroxylázy. V ledvinách, ale i ve většině dalších tkání, existuje enzym 24-hydroxyláza, která katalyzuje syntézu 24,25(OH)2D z 25(OH)D, především však inaktivuje 1α,25(OH)2D jeho přeměnou na 1α,24,25(OH)3D. Na vlastní inaktivaci se 1α,25(OH)2D podílí tím, že stimuluje expresi 24-hydroxylázy.

Málo je známo o dalších metabolitech vitaminu D, ať již se jedná o 23,25(OH)2D, nebo o různé oxidované formy typu 25-OH-24 oxo-D3, 23,25(OH)2–24-oxo-D3, a také o glukuronidové nebo sulfátové konjugáty. Dalším potenciálně biologicky aktivním metabolitem vitaminu D nalezeným v řadě tkání je epimer 1α,25(OH)2D, tj. 3-epi-1α,25(OH)2D vznikající z 25(OH)D účinkem hydroxylázy nepatřící do rodiny cytochrom P450 enzymů. Celkem bylo izolováno a chemicky charakterizováno více než 37 různých metabolitů vitaminu D. 1α,25(OH)2D realizuje svoji biologickou funkci interakcí s jaderným receptorem specifickým pro vitamin D (VDR), ale i negenomicky interakcí s membránovými receptory cílových buněk.

Ledviny jsou téměř výlučným zdrojem cirkulujícího 1α,25(OH)2D, ale i řada dalších buněk a tkání exprimuje 1α-hydroxylázu, a mohou tak lokálně autokrinním či parakrinním mechanizmem vytvářet 1α,25(OH)2D. Tento hormon je klíčovým regulátorem homeostázy kalcia a fosforu ve smyslu absorpce střevního kalcia a mobilizace kalcia z kosti, ale má také silné antiproliferativní, prodiferenciační, proapoptické a imunomodulační (suprese humorální odezvy, aktivace celulární odezvy) účinky. Tyto vlastnosti 1α,25(OH)2D jsou úzce spjaté s karcinogenezí a dostupnost 25(OH)D pro lokální biosyntézu 1α,25(OH)2D v extrarenálních buňkách je významná v prevenci maligních onemocnění.

Dlouhodobý nedostatek vitaminu D a z něho vyplývající snížení hladiny 1α,25(OH)2D způsobuje křivici u dětí a osteomalacii u dospělých. Spolu s nedostatkem kalcia a dalšími změnami souvisejícími se vzrůstajícím věkem se podílí i na osteoporóze, alopecii, slábnutí svalů, vývoji sekundárního hyperparatyreoidizmu u pacientů s chronickou renální nedostatečností a současný výzkum naznačuje i jeho spojení se zvýšeným krevním tlakem, s depresí, s poruchami imunitního systému vedoucími k mnohočetné skleróze, k revmatické artritidě a k diabetu. Všechny buňky imunitního systému exprimují VDR a jeho stimulace má za následek aktivaci vrozené imunitní odezvy realizované obecným obranným mechanizmem (makrofágy apod), naopak ale dochází k potlačení specifické imunitní odezvy selektivní inhibicí antigenem aktivovaných T buněk. Nedostatek vitaminu D má za následek nedostatečnou aktivaci VDR, což umožňuje vývoj autoreaktivních T-lymfocytů, naopak přítomnost 1α,25(OH)2D a funkčního VDR nastoluje rovnováhu a zabraňuje vývoji autoimunity. Téměř všechny VDR pozitivní buňky odpovídají na interakci s 1α,25(OH)2D utlumením buněčné replikace v důsledku snížení hyperfosforylace proteinů podílejících se na buněčném cyklu a u většiny tkání dochází k indukci diferenciace. V současné době roste počet studií, ze kterých vyplývá vztah mezi prevalencí výskytu rakoviny především tlustého střeva, prostaty a prsu, ale i řady dalších maligních onemocnění, a mírou zásobení organizmu vitaminem D.

Z výše uvedeného je patrné, že správné stanovení vitaminu D a jeho metabolitů z hlediska přesnosti, ale především pravdivosti, je velkou výzvou do budoucnosti a vývoj technik, které toto správné stanovení umožní, bude odrážet potřeby, které neustále vzrůstají vzhledem k významu vitaminu D a jeho metabolitů. Výhodou imunoanalytických postupů je velká kapacita stanovení a analytická citlivost v řádu pg/zkumavku. Imunoanalytické stanovení hydroxylovaných metabolitů vitaminu D je ale také zatíženo řadou problémů, přičemž největším je specificita použité protilátky, která může zkříženě interagovat jak s metabolity vitaminu D3, tak i s metabolity vitaminu D2. Poměrně vysoké zkřížené reakce mají protilátky některých výrobců vůči 24,25(OH)2D, přičemž v cirkulaci je tento metabolit v nanomolovém množství. Zásadní je rovněž problém se specificitou protilátky při stanovení 1α,25(OH)2D, jehož koncentrace je přibližně o 3 řády nižší než koncentrace 25(OH)D. Nedostatečně účinný proces separace 1α,25(OH)2D od 25(OH)D nebo použití protilátky vykazující i jen nízkou zkříženou reakci vůči 25(OH)D bude mít za následek falešně vysoké výsledky stanovení 1α,25(OH)2D. Velmi málo je diskutována specificita používaných protilátek vůči konjugátům (sulfát, glukuronid) hydroxylovaných metabolitů vitaminu D, přičemž v cirkulaci může být i stejné množství např. 25(OH)D3 a 25(OH)D3–3-sulfátu. Dalším problémem může být silná vazba metabolitů vitaminu D na vitamin D vazebný protein (VDBP), který váže přibližně 85–88 % metabolitů vitaminu D v cirkulaci, zbytek cirkulujících metabolitů je vázán na albumin, pouze 0,03 % 25(OH)D a 0,4 % 1α,25(OH)2D je v cirkulaci volných. Precipitace séra organickými rozpouštědly nebo kyselinami může vést ke ztrátám způsobeným koprecipitací metabolitů vitaminu D s vazebnými proteiny. Problémem je tedy standardizace použitých imunoanalytických kitů, kdy různé typy esejí dávají různé výsledky, na jejichž základě jsou odvozovány i různá referenční rozmezí a přijímají se klinická rozhodnutí, která nemusí odrážet skutečný stav zásobení populace vitaminem D.

Chromatografické postupy mají velkou výhodu ve skutečnosti, že umožňují separaci jednotlivých odlišně hydroxylovaných a jinak derivatizovaných (různé typy konjugátů, např. sulfáty a glukuronidy) metabolitů vitaminu D včetně rozlišení metabolitů cholekaciferolu (D3) od metabolitů ergokalciferolu (D2), nebo např. stanovení 3-epi-24,25(OH)2D3 vedle 24,25(OH)2D3. Nevýhodou mohou být v oblasti rutinních analýz relativně složité přípravy vzorků před vlastní chromatografickou analýzou (extrakce organickými rozpouštědly často spojená s extrakcí na pevné fázi a další chromatografickou předseparací), metody jsou limitovány kapacitně, a dihydroxylované metabolity vitaminu D [především 1α,25(OH)2D] vyžadují citlivější postup detekce, než je obvyklá spektrofotometrická detekce v ultrafialové oblasti.

Obecně výhodné z hlediska univerzálnosti, citlivosti detekce, specificity, i z časového hlediska jsou postupy založené na kombinaci vysokoúčinného kapalinového chromatografu (HPLC) pracujícího v režimu reverzní fáze (RP-HPLC) s detekcí analytu provedenou na hmotovém detektoru (MS), který většinou pracuje v tandemovém zapojení (MS/MS). Je zde dvojí separační princip, tj. chromatografický a hmotově-spektrometrický, založený na poměru hmoty iontu k jeho náboji. Jednoznačnost stanovení jednotlivých metabolitů ve spektru řady dalších metabolitů vitaminu D, použití izotopicky značených standardů eliminujících vliv biologické matrice při kvantifikaci a další vývoj spojený s automatizací vedou k závěru, že imunoanalytické postupy stanovení metabolitů vitaminu D jsou nebo v blízké budoucnosti budou technikou MS překonány, a již nyní jsou postupy HPLC-MS/MS užívány jako vhodná referenční metoda stanovení metabolitů vitaminu D. Limitujícím faktorem je vysoká pořizovací cena přístroje, který zatím není běžnou součástí klinicko-biochemické laboratoře.

doc. Ing. Radovan Bílek, CSc.

rbilek@endo.cz

Endokrinologický ústav, Praha

www.endo.cz

Doručeno do redakce 20. 6. 2017


Štítky
Diabetologie Endokrinologie Interní lékařství

Článek vyšel v časopise

Vnitřní lékařství

Číslo 6

2017 Číslo 6

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se